采用Oligo 6和Primer Premier 5.0進行引物設(shè)計。引物設(shè)計主要參考以下原則：

1）引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。

2）引物長度一般在15-30堿基之間。

3）G+C含量：應(yīng)在40%-60%之間，PCR擴增中的復(fù)性溫度一般較Tm值低等于引物的Tm值減去5-10°C。引物長度小于20 bp時，其Tm恒等于4×（G+C）+2×（(A+T）

4）引物3’端要避開密碼子的第3位。

5）引物3’端不能選擇A，最好選擇T。

6）堿基要隨機分布。

7）引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。

8）引物的5’端可以修飾，而3’端不可修飾。

9）擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。

10）引物應(yīng)具有特異性。